رنگ آمیزی گرم باکتری (صفر تا صد روش + ویدیو) را در ساینس بازار مشاهده کنید. این رنگ آمیزی تست مهم و اولیه در ازمایشگاه تشخیص طبی بخش میکروبیولوژی جهت شناسایی و افتراق گونه های مختلف باکتریایی می باشد.
مراحل رنگ آمیزی گرم باکتری
رنگ آمیزی گرم روشی رایج است که در میکروبیولوژی برای تمایز باکتری ها به دو گروه بر اساس ترکیب دیواره سلولی استفاده می شود. این روش توسط باکتری شناس دانمارکی هانس کریستین گرام در سال 1884 ابداع شد و امروزه نیز به طور گسترده مورد استفاده قرار می گیرد.
فرآیند رنگ آمیزی گرم شامل چندین مرحله است:
.
1. یک نمونه باکتری ابتدا با استفاده از گرما یا یک تثبیت کننده شیمیایی روی یک لام ثابت می شود.
.
2. سپس باکتری های ثابت با کریستال ویولت رنگ آمیزی می شوند، رنگ بنفش که به لایه پپتیدوگلیکان دیواره سلولی متصل می شود.
.
3. سپس لام با محلول لوگول (خرید محلول لوگول) رنگ می شود، که به عنوان یک ماده خشک کننده عمل می کند تا اتصال کریستال بنفش به باکتری را افزایش دهد.
.
4. لام با الکل استون شسته می شود که به عنوان رنگ بر عمل می کند. این مرحله بسیار مهم است زیرا بین باکتری های گرم مثبت و گرم منفی تمایز ایجاد می شود. باکتری های گرم مثبت رنگ کریستال بنفش را حفظ می کنند، در حالی که باکتری های گرم منفی رنگ زدایی می شوند.
.
5. سپس لام را با سافرانین، رنگ قرمزی که باکتری های گرم منفی را رنگ دار می کند، رنگ آمیزی می کنند.
.
6. لام حاوی اسمیر باکتری رنگ آمیزی شده زیر میکروسکوپ بررسی می شود. باکتری های گرم مثبت بنفش و باکتری های گرم منفی صورتی به نظر می رسند.
.
روش رنگ آمیزی گرم برای شناسایی سریع و طبقه بندی باکتری ها بر اساس ساختار دیواره سلولی آنها مفید است. باکتری های گرم مثبت دارای یک لایه پپتیدوگلیکان ضخیم در دیواره سلولی خود هستند که لکه کریستال بنفش را حفظ می کند، در حالی که باکتری های گرم منفی دارای یک لایه پپتیدوگلیکان نازک و یک غشای خارجی هستند که به راحتی رنگ می شود.
به طور کلی، رنگ‌آمیزی گرم یک تکنیک ساده و در عین حال قدرتمند است که برای شناسایی و طبقه‌بندی باکتری‌ها در آزمایشگاه‌های میکروبیولوژی ضروری است.
روش عملی انجام رنگ آمیزی گرم باکتری ها
تکنیک رنگ‌آمیزی گرم روشی پرکاربرد برای تمایز باکتری‌ها به گروه‌های گرم مثبت و گرم منفی بر اساس ویژگی‌های دیواره سلولی است. در اینجا یک روش عملی گام به گام برای انجام رنگ آمیزی گرم باکتری ها آورده شده است:
مواد مورد نیاز:
– کشت باکتری
– اسلایدهای شیشه ای گرما ثابت با اسمیر باکتریایی
– لکه بنفش کریستالی
– ید گرم (مختلف)
– عامل رنگ‌زدایی (مانند اتانول یا استون)
– ضد لکه سافرانین
– آب مقطر
– میکروسکوپ
روش:
1. تهیه اسمیر باکتری: یک قطره کوچک آب را روی یک لام شیشه ای تمیز قرار دهید، سپس از یک حلقه استریل برای برداشتن مقدار کمی از کشت باکتری و مخلوط کردن آن با آب استفاده کنید. مخلوط را در یک لایه نازک روی لام پخش کنید و اجازه دهید تا با هوای خشک شود یا با چند بار گذراندن لام از روی شعله ثابت شود.
2. فرآیند رنگ آمیزی:
آ. اسمیر باکتریایی که با حرارت تثبیت شده است را با لکه کریستال ویولت بپوشانید و بگذارید 1 دقیقه بماند. اسلاید را با آب مقطر بشویید.
ب ید گرم (موادانت) را به لام اضافه کنید و بگذارید 1 دقیقه بماند. اسلاید را با آب مقطر بشویید.
ج. اسلاید را با آغشته کردن ملایم با ماده رنگ‌برنده (اتانول یا استون) برای چند ثانیه بی‌رنگ کنید. اسلاید را بلافاصله با آب مقطر بشویید.
د لام را با سافرانین به مدت 1 دقیقه ضد ضربه بزنید. اسلاید را با آب مقطر بشویید.
3. اسلاید را به آرامی با کاغذ بیبولی بمالید تا آب اضافی آن گرفته شود و اجازه دهید لام در هوا خشک شود.
4. اسمیر باکتریایی رنگ آمیزی شده را با استفاده از غوطه وری در روغن با بزرگنمایی 1000 برابر زیر میکروسکوپ بررسی کنید. باکتری های گرم مثبت بنفش/آبی و باکتری های گرم منفی صورتی/قرمز به نظر می رسند.
5. مشاهدات خود از جمله مورفولوژی و ترتیب باکتری های رنگ آمیزی شده را ثبت کنید و نتایج رنگ آمیزی را با کنترل های شناخته شده تایید کنید.
6. لام لکه دار را به درستی دور بیندازید و مواد لکه دار را برای استفاده در آینده تمیز کنید.
با پیروی از این روش گام به گام و تمرین روش آزمایشگاهی خوب، می توانید رنگ آمیزی گرم باکتری ها را به طور دقیق و موثر انجام دهید تا بین گونه های باکتری گرم مثبت و گرم منفی تمایز قائل شوید.
نکات کاربردی عملی انجام رنگ آمیزی گرم برای اطمینان از نتایج دقیق و قابل اعتماد
هنگام انجام رنگ آمیزی گرم باکتری ها، چندین نکته ظریف و نکات کاربردی وجود دارد که برای اطمینان از نتایج دقیق و قابل اعتماد مهم هستند:
.
1. استفاده از کشت های باکتریایی تازه: استفاده از کشت های باکتریایی تازه برای رنگ آمیزی گرم بسیار مهم است زیرا کشت های قدیمی ممکن است دیواره های سلولی تخریب شده داشته باشند که منجر به نتایج نادرست می شود.
.
2. تثبیت اسمیر باکتری با حرارت: تثبیت حرارتی اسمیر باکتری روی لام به چسبیدن باکتری ها به لام کمک می کند و از شسته شدن آنها در طول فرآیند رنگ آمیزی جلوگیری می کند.
.
3. استفاده از رنگ های با کیفیت بالا: از لکه های کریستال ویولت، ید و سافرانین با کیفیت بالا برای اطمینان از نتایج بهینه رنگ استفاده کنید.
.
4. از لام ها و لامل های شیشه ای تمیز استفاده کنید: اطمینان حاصل کنید که لام ها و لاستیک های شیشه ای تمیز و عاری از هر گونه آلودگی که می تواند در فرآیند رنگ آمیزی اختلال ایجاد کند.
.
5. از رنگ زدایی بیش از حد خودداری کنید: مراقب باشید که لام را با الکل یا استون بیش از حد رنگ نکنید زیرا این امر می تواند منجر به نتایج منفی کاذب برای باکتری های گرم مثبت شود.
.
6. استفاده از یک تایمر: از یک تایمر استفاده کنید تا مطمئن شوید که فرآیند رنگ آمیزی برای مدت زمان صحیح در هر مرحله انجام می شود.
.
7. استفاده از میکروسکوپ با غوطه وری روغن: برای مشاهده دقیق باکتری های لکه دار، از میکروسکوپ با لنزهای غوطه ور روغن برای بزرگنمایی و وضوح بیشتر استفاده کنید.
.
8. روش خوب آزمایشگاهی را تمرین کنید: از تکنیک های مناسب آسپتیک پیروی کنید و یک منطقه کار تمیز و سازمان یافته را برای جلوگیری از آلودگی نمونه ها حفظ کنید.
.
9. نتایج را با دقت تفسیر کنید: زمانی را صرف مشاهده دقیق باکتری های رنگ شده در زیر میکروسکوپ کنید و باکتری های گرم مثبت و گرم منفی را بر اساس رنگ و مورفولوژی آنها به درستی شناسایی کنید.
.
با پیروی از این جزئیات دقیق و نکات کاربردی، می‌توانید اطمینان حاصل کنید که روش رنگ‌آمیزی گرم باکتری‌ها با دقت و اطمینان انجام می‌شود و منجر به شناسایی و طبقه‌بندی دقیق گونه‌های باکتریایی می‌شود.
.
تفسیر نتایج رنگ آمیزی گرم باکتری ها و نحوه افتراق آن ها
تفسیر نتایج رنگ‌آمیزی گرم باکتری‌ها شامل مشاهده رنگ و مورفولوژی باکتری‌های رنگ‌شده در زیر میکروسکوپ و تمایز بین باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی بر اساس این ویژگی‌ها است. در اینجا چند نکته کلیدی وجود دارد که هنگام تفسیر نتایج باید در نظر گرفته شود:
1. رنگ: باکتری های گرم مثبت پس از رنگ آمیزی با کریستال ویولت و ید بنفش یا آبی به نظر می رسند، در حالی که باکتری های گرم منفی پس از رنگ آمیزی متقابل با سافرانین صورتی یا قرمز به نظر می رسند.
2. ساختار دیواره سلولی: باکتری های گرم مثبت دارای یک لایه پپتیدوگلیکان ضخیم در دیواره سلولی خود هستند که لکه بنفش کریستالی را حفظ می کند. در مقابل، باکتری‌های گرم منفی دارای یک لایه پپتیدوگلیکان نازک و یک غشای خارجی هستند که به راحتی رنگ‌زدایی می‌شود و منجر به جذب رنگ ضد سافرانین می‌شود.
3. مورفولوژی: علاوه بر رنگ، مورفولوژی باکتری های رنگ شده شامل شکل (کوکسی، باسیل، اسپیریل) و آرایش آنها (خوشه ها، زنجیره ها، جفت) را نیز رعایت کنید.
4. شفافیت رنگ‌آمیزی: باکتری‌های گرم مثبت باید لکه بنفش را در طول فرآیند رنگ‌آمیزی حفظ کنند، در حالی که باکتری‌های گرم منفی باید فقط پس از رنگ‌آمیزی صورتی یا قرمز ظاهر شوند.
5. تأیید با کنترل: توصیه می شود برای اطمینان از صحت نتایج، کنترل های باکتریایی گرم مثبت و گرم منفی شناخته شده را در هر مرحله رنگ آمیزی شامل شود.
تمایز بین باکتری های گرم مثبت و گرم منفی برای شناسایی و طبقه بندی گونه های باکتریایی بسیار مهم است. با مشاهده دقیق رنگ، مورفولوژی و ویژگی‌های رنگ‌آمیزی باکتری‌ها، می‌توانید نتایج رنگ‌آمیزی گرم را به دقت تفسیر کنید و با اطمینان بین دو گروه تفاوت قائل شوید.
تشخیص مرفلوژی باکتری ها زیر میکروسکوپ
شناسایی مورفولوژی باکتری های مختلف در زیر میکروسکوپ شامل مشاهده شکل، اندازه و آرایش آنها است. در اینجا برخی از مورفولوژی های باکتریایی رایج و نحوه ظاهر آنها در زیر میکروسکوپ آورده شده است:
.
1. کوکسی (مفرد: coccus):
– کوکسی ها باکتری های کروی یا گرد هستند.
– آنها می توانند به صورت تک سلولی، جفت (دیپلوکوک)، زنجیره ای (استرپتوکوک)، خوشه ای (استافیلوکوک)، یا در گروه های چهارتایی (تتراد) ظاهر شوند.
– نمونه هایی از باکتری های کوکسی شامل استافیلوکوکوس اورئوس، استرپتوکوک پنومونیه و نایسریا گونوره است.
.
2. باسیل (مفرد: باسیل):
– باسیل ها باکتری های میله ای شکلی هستند که کشیده و استوانه ای هستند.
– آنها می توانند به صورت تک سلولی، جفتی (دیپلوباسیلی)، زنجیره ای (استرپتوباسیلی)، یا به صورت خوشه ای ظاهر شوند.
– نمونه هایی از باکتری های باسیل عبارتند از اشریشیا کلی، باسیلوس آنتراسیس و مایکوباکتریوم توبرکلوزیس.
.
3. اسپیرال (مفرد: اسپیریلوم) و اسپیروکت:
– اسپیرال ها باکتری های مارپیچی شکل با شکل مارپیچ سفت و سخت هستند.
– اسپیروکت ها باکتری های مارپیچی شکل با شکل مارپیچ انعطاف پذیر هستند.
– آنها می توانند به صورت تک سلولی یا در خوشه های شل ظاهر شوند.
– نمونه هایی از باکتری های اسپیرلا عبارتند از هلیکوباکتر پیلوری، در حالی که نمونه هایی از اسپیروکت ها شامل ترپونما پالیدوم است.
.
4. باکتری پلئومورفیک:
– برخی از باکتری ها پلئومورفیسم را نشان می دهند، به این معنی که می توانند اشکال و اندازه های متغیری داشته باشند.
– این باکتری ها ممکن است به صورت ترکیبی از کوکسی ها، باسیل ها یا اشکال نامنظم زیر میکروسکوپ ظاهر شوند.
– نمونه هایی از باکتری های پلئومورفیک شامل کورینه باکتریوم دیفتری و مایکوپلاسما پنومونیه است.
.
هنگام شناسایی مورفولوژی باکتری ها در زیر میکروسکوپ، استفاده از تکنیک های رنگ آمیزی مناسب، مانند رنگ آمیزی گرم، برای افزایش کنتراست و دید سلول های باکتری مهم است. علاوه بر این، حفظ یک میکروسکوپ تمیز و کالیبره شده، تنظیم نور و تنظیمات فوکوس، و تمرین مهارت‌های مشاهده دقیق برای شناسایی دقیق مورفولوژی باکتری‌های مختلف ضروری است.
