آیا به دنبال روشی دقیق و سریع برای شناسایی و اندازه‌گیری مواد ژنتیکی در نمونه‌های آزمایشگاهی خود هستید؟ در دنیای امروز، آزمایش‌های مولکولی مانند Real-Time PCR نقش کلیدی در تشخیص‌های دقیق و سریع بیماری‌ها و مطالعات ژنتیکی دارند. این تکنیک به دانشمندان و پزشکان امکان می‌دهد تا با دقت بالا و در کوتاه‌ترین زمان ممکن، DNA یا RNA هدف را شناسایی و تحلیل کنند. با ما در این مقاله از وبلاگ ساینس بازار همراه باشید تا با یکی از خدمات ما، یعنی انجام تست مولکولی Real-Time PCR، آشنا شوید.

.

Real time pcr چیست؟

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز در زمان واقعی (Real-time PCR) یک روش کمی دقیق برای اندازه‌گیری DNA یا RNA (که به cDNA تبدیل شده) است. این روش با استفاده از پرایمرها DNA را تکثیر کرده و در هر مرحله از فرآیند، میزان محصول را از طریق فلورسانس اندازه‌گیری می‌کند. Real-time PCR نسبت به روش‌های معمولی سریع‌تر است، نیاز به غلظت کمتری از نمونه دارد و نیازی به الکتروفورز ژل برای تأیید محصول نیست، که خطر آلودگی را نیز کاهش می‌دهد. این روش به‌طور گسترده در تحقیقات ویروسی و باکتریایی استفاده شده و به دلیل دقت و سرعت بالا، در تشخیص‌های ژنتیکی کاربرد فراوانی دارد.

.

مزایا تست Real time pcr

تست Real-Time PCR یکی از پیشرفته‌ترین تست‌های مولکولی برای شناسایی و اندازه‌گیری DNA و RNA است. در این بخش به بررسی مزایای این روش خواهیم پرداخت.

• دقت بالا و کمّی‌سازی دقیق: این روش به محققان امکان می‌دهد تا مقدار دقیق DNA یا RNA موجود در نمونه را با دقت بسیار بالا اندازه‌گیری کنند.
• سرعت بالا: نسبت به روش‌های معمولی PCR، این تکنیک زمان تشخیص را به‌طور قابل‌توجهی کاهش می‌دهد.
• حساسیت بالا: Real-Time PCR توانایی شناسایی مقادیر بسیار کم DNA یا RNA را دارد که آن را برای نمونه‌های با غلظت پایین ایده‌آل می‌کند.
• کاهش خطر آلودگی: به دلیل عدم نیاز به مراحل پس از PCR مانند الکتروفورز ژل، خطر آلودگی نمونه‌ها به حداقل می‌رسد.
• تکرارپذیری و دقت در نتایج: امکان مقایسه دقیق نتایج بین آزمایش‌ها و آزمایشگاه‌های مختلف فراهم است.
• انعطاف‌پذیری در کاربردها: این روش می‌تواند برای تشخیص طیف گسترده‌ای از ویروس‌ها، باکتری‌ها و ژن‌های مرتبط با بیماری‌ها مورد استفاده قرار گیرد.

.

مواد لازم برای real time pcr

در این بخش موادی که برای انجام تست real time pcr لازم است را معرفی می‌کنیم.

کیت استخراج Total RNA

این کیت برای جداسازی و خالص‌سازی RNA از نمونه‌های بیولوژیکی استفاده می‌شود. استخراج RNA با کیفیت و خالص اولین و اساسی‌ترین مرحله در آزمایش‌های مولکولی مانند Real-Time PCR است، زیرا RNA به عنوان الگوی اصلی برای سنتز cDNA عمل می‌کند. این کیت‌ها معمولاً با استفاده از ستون‌های سیلیکا یا روش‌های رسوب‌دهی، RNA را از سایر اجزای سلولی جدا می‌کنند.

کیت ساخت cDNA

پس از استخراج RNA، این کیت برای تبدیل RNA به cDNA مورد استفاده قرار می‌گیرد. این فرآیند به کمک آنزیم ترانس‌کریپتاز معکوس انجام می‌شود. cDNA به عنوان الگو در مراحل بعدی Real-Time PCR استفاده می‌شود، زیرا PCR نمی‌تواند به‌طور مستقیم با RNA کار کند. دقت در سنتز cDNA تضمین می‌کند که میزان RNA موجود به‌درستی به cDNA تبدیل شود و اطلاعات ژنتیکی حفظ شود.

کیت Master Mix Real-Time PCR

این کیت شامل تمامی ترکیبات لازم برای انجام واکنش PCR است، از جمله نوکلئوتیدها (dNTPs)، پرایمرها، آنزیم DNA پلیمراز و رنگ‌های فلورسانس مانند SYBR Green. Master Mix یک محلول آماده برای شروع واکنش‌های PCR است و تضمین می‌کند که تمامی اجزای لازم در غلظت‌های مناسب موجود هستند. در این مرحله، نمونه cDNA به همراه Master Mix وارد واکنش PCR شده و تکثیر می‌شود.

دستگاه Thermo Cycler

این دستگاه مسئول اجرای چرخه‌های حرارتی مورد نیاز برای انجام PCR است. Thermo Cycler با تنظیم دقیق دما در مراحل مختلف، مانند دناتوراسیون DNA، اتصال پرایمرها و گسترش رشته‌های DNA، شرایط مناسب را برای تکثیر DNA فراهم می‌کند. در Real-Time PCR، این دستگاه به یک سیستم فلورومتری مجهز است که به‌طور لحظه‌ای میزان محصول PCR را در هر چرخه اندازه‌گیری می‌کند.

.

مراحل انجام ریل تایم پی سی آر (Real-Time PCR)

درادامه به بررسی مراحل انجام تست Real-Time PCR خواهیم پرداخت و هر مرحله را به‌طور کامل توضیح خواهیم داد تا با فرآیند این تکنیک مهم مولکولی آشنا شوید.

استخراج RNA از نمونه

در این مرحله، RNA از نمونه‌های بیولوژیکی مانند بافت یا سلول جدا می‌شود. برای این کار از کیت‌های استخراج RNA استفاده می‌شود که RNA خالص و بدون آلودگی به سایر اجزای سلولی را فراهم می‌کنند. کیفیت RNA استخراج‌شده بسیار مهم است، زیرا RNA آسیب‌دیده یا آلوده به آنزیم‌های تخریب‌کننده RNAse می‌تواند نتیجه آزمایش را تحت تأثیر قرار دهد.

ساخت cDNA از RNA

چون PCR به‌طور مستقیم با RNA کار نمی‌کند، RNA باید به DNA مکمل (cDNA) تبدیل شود. این کار توسط آنزیم ترانس‌کریپتاز معکوس انجام می‌شود که RNA تک‌رشته‌ای را به cDNA دو‌رشته‌ای تبدیل می‌کند. این cDNA به‌عنوان الگو برای مراحل بعدی PCR استفاده می‌شود. در این مرحله، از کیت‌های ساخت cDNA استفاده می‌شود که به طور اختصاصی برای این فرآیند طراحی شده‌اند.

آماده‌سازی واکنش PCR با استفاده از Master Mix

پس از ساخت cDNA، مرحله بعدی آماده‌سازی واکنش PCR است. این کار با ترکیب cDNA به‌دست‌آمده، پرایمرهای اختصاصی و مواد موجود در کیت Master Mix انجام می‌شود. Master Mix شامل تمامی اجزای لازم برای تکثیر DNA مانند نوکلئوتیدها، آنزیم DNA پلیمراز و مواد فلورسانس برای سنجش در زمان واقعی است. این مخلوط در شرایط دقیق دمایی در دستگاه Thermo Cycler قرار می‌گیرد.

اجرای PCR با Thermo Cycler

دستگاه Thermo Cycler چرخه‌های حرارتی لازم برای تکثیر DNA را انجام می‌دهد. هر چرخه شامل مراحل دناتوراسیون (جدا شدن دو رشته DNA) اتصال پرایمرها به توالی هدف و گسترش DNA توسط آنزیم پلیمراز است. در Real-Time PCR هر چرخه، دستگاه میزان فلورسانس را اندازه‌گیری می‌کند تا مقدار DNA تولیدشده را اندازه‌گیری کند.

تحلیل نتایج و کمی‌سازی

پس از تکمیل چرخه‌ها، نتایج به‌صورت منحنی‌های تقویت (amplification curves) روی صفحه نمایش داده می‌شود. این منحنی‌ها نشان می‌دهند که در هر چرخه چه مقدار محصول PCR تولید شده است. بر اساس این اطلاعات، می‌توان میزان دقیق DNA یا RNA موجود در نمونه اولیه را تعیین کرد. روش‌های کمی‌سازی شامل کمی‌سازی مطلق (با استفاده از منحنی‌های استاندارد) یا کمی‌سازی نسبی (مقایسه با یک ژن کنترل) است.

در ساینس بازار، تست‌های Real-Time PCR و PCR با بالاترین سطح دقت و تحت نظارت اساتید برجسته دانشگاهی انجام می‌شوند. با بهره‌گیری از تجهیزات پیشرفته و رعایت استانداردهای علمی بین‌المللی، نتایجی دقیق و قابل اعتماد را برای شما فراهم می‌کنیم. هدف ما ارائه خدمات تخصصی و حرفه‌ای در حوزه تشخیص‌های مولکولی است.

.

بررسی کمی در Real time PCR

در Real-Time PCR، بررسی کمی به دو روش اصلی انجام می‌شود: کمی‌سازی مطلق و کمی‌سازی نسبی. هر کدام از این روش‌ها کاربردهای خاص خود را دارند و بسته به نوع آزمایش، یکی از آن‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد.

کمی‌سازی مطلق

در روش کمی‌سازی مطلق، مقدار دقیق DNA یا RNA هدف در نمونه تعیین می‌شود. برای این کار، یک منحنی استاندارد با استفاده از نمونه‌هایی با غلظت‌های مشخص از DNA یا RNA ساخته می‌شود. سپس نتایج PCR نمونه‌های آزمایشی با این منحنی استاندارد مقایسه شده و غلظت دقیق مواد ژنتیکی در نمونه تعیین می‌شود. این روش برای آزمایش‌هایی که نیاز به تعیین دقیق تعداد نسخه‌های ژن دارند، مانند اندازه‌گیری بار ویروسی، بسیار مفید است.

کمی‌سازی نسبی

در روش کمی‌سازی نسبی، میزان بیان یک ژن هدف نسبت به یک ژن مرجع (کنترل داخلی) در همان نمونه اندازه‌گیری می‌شود. این روش معمولاً برای مقایسه بیان ژن‌ها در شرایط مختلف استفاده می‌شود، مانند بررسی تغییرات بیان ژن‌ها در شرایط بیماری یا پس از درمان. ژن مرجع باید به‌طور پایدار در شرایط مختلف بیان شود تا بتوان به‌درستی بیان نسبی ژن هدف را ارزیابی کرد.

هر دو روش ابزارهای قدرتمندی برای آنالیز داده‌های مولکولی هستند و انتخاب روش مناسب به هدف آزمایش و نوع داده‌های مورد نظر بستگی دارد.

.

تفاوت pcr و real time

در این بخش به مقایسه تفاوت‌های بین PCR معمولی و Real-Time PCR می‌پردازیم تا درک بهتری از کاربردها و ویژگی‌های هر یک داشته باشید.

.

جمع بندی و خلاصه

در این مقاله، به بررسی تست Real-Time PCR پرداختیم و به مزایا، مراحل انجام و کاربردهای آن اشاره کردیم. همچنین تفاوت‌های بین PCR معمولی و Real-Time PCR را به‌صورت مقایسه‌ای ارائه داده و دقت بالای Real-Time PCR در تشخیص و کمّی‌سازی مواد ژنتیکی را توضیح دادیم. در پایان، دو روش کمی‌سازی مطلق و نسبی در Real-Time PCR را معرفی کردیم تا درکی جامع‌تر از این تکنیک مولکولی حاصل شود.

در صورت داشتن هرگونه سوال درباره تست Real-Time PCR، می‌توانید آن را در بخش دیدگاه‌های ساینس بازار مطرح کنید. پشتیبانان ما به صورت ۲۴ ساعته آماده پاسخ‌گویی به شما هستند.

.

سوالات متداول

آیا ساینس بازار تست Real-Time PCR را برای تشخیص انواع ویروس‌ها هم انجام می‌دهد؟

بله. ساینس بازار تست Real-Time PCR را برای تشخیص طیف گسترده‌ای از ویروس‌ها، از جمله ویروس‌های انسانی و ویروس‌های مرتبط با حیوانات و گیاهان انجام می‌دهد. این تست با دقت بالا و با استفاده از تجهیزات پیشرفته انجام می‌شود.

تفاوت بین Real-Time PCR و PCR معمولی چیست؟

تفاوت اصلی در این است که Real-Time PCR به شما اجازه می‌دهد محصول PCR را در حین انجام واکنش و به‌صورت کمی رصد کنید، در حالی که PCR معمولی فقط پس از پایان واکنش و با استفاده از روش‌هایی مانند الکتروفورز ژل محصول را مشاهده می‌کند.

آیا ساینس بازار اینماد دارد؟

بله. ساینس بازار دارای اینماد (نماد اعتماد الکترونیکی) است که تضمین می‌کند تمامی فعالیت‌های تجاری و خرید و فروش در این سایت به‌صورت قانونی و ایمن انجام می‌شود.