انجام تست Real Time PCR در ساینس بازار 

.

.

سفارش انجام تست Real Time PCR در ساینس بازار 

.

آیا تابه‌حال فکر کرده‌اید که چگونه می‌توان در هر مرحله از یک واکنش ژنتیکی، میزان دقیق DNA یا RNA را اندازه‌گیری کرد؟ آموزش Real-Time PCR در ساینس بازار به شما کمک می‌کند تا با این تکنیک پیشرفته و ضروری در زیست‌شناسی مولکولی آشنا شوید .Real-Time PCR با ارائه داده‌های به‌روز و دقیق، به پژوهشگران این امکان را می‌دهد تا تغییرات ژنتیکی را با حساسیت و دقت بالا تجزیه‌وتحلیل کنند. در این مقاله، اصول، مزایا و مراحل اجرای این تکنیک را به‌تفصیل بررسی خواهیم کرد تا شما بتوانید از این ابزار قدرتمند در تحقیقات علمی و بالینی بهره‌برداری کنید.

.

به نقل از سایت academic :

Real-Time PCR، تکنیک پیشرفته‌ای است که برای اندازه‌گیری و تجزیه‌وتحلیل دقیق میزان DNA یا RNA استفاده می‌شود. این روش به محققان این امکان را می‌دهد که بادقت بالا تغییرات ژن‌ها را در هر مرحله از واکنش‌های مولکولی بررسی کنند.

.

معرفی Real-Time PCR

Real-Time PCR که به نام PCR کمی نیز شناخته می‌شود، یک تکنیک پیشرفته و دقیق در زیست‌شناسی مولکولی است که به طور ویژه برای اندازه‌گیری و تحلیل DNA یا RNA طراحی شده است. بر خلاف روش سنتی PCR که محصول واکنش را فقط در پایان فرآیند مشاهده و تحلیل می‌کند، Real-Time PCR  این امکان را فراهم می‌آورد که تغییرات در میزان DNA یا RNA در هر مرحله از واکنش به طور هم‌زمان و در زمان واقعی پایش شود. این تکنیک به کمک مواد فلورسانس که با DNA یا RNA هدف واکنش می‌دهند، میزان محصولات را در هر چرخه از واکنش اندازه‌گیری می‌کند. استفاده از فلورسانس به محققان این امکان را می‌دهد که تغییرات در سطح ژن‌ها را بادقت بالا و در زمان واقعی مشاهده کنند و نتایج به‌روز را در هر مرحله دریافت کنند.

.

اهمیت و کاربردهای Real-Time PCR

Real-Time PCR  به دلیل دقت بالا، حساسیت بسیار و قابلیت ارائه نتایج در زمان واقعی، به یکی از ابزارهای کلیدی در زیست‌شناسی مولکولی و پزشکی تبدیل شده است. اهمیت و کاربردهای این تکنیک به شرح زیر است:

تحقیقات ژنتیکی

در تحقیقات ژنتیکی، Real-Time PCR به‌عنوان ابزاری قوی و دقیق برای اندازه‌گیری تغییرات در سطح بیان ژن‌ها و شناسایی واریانت‌های ژنتیکی مورداستفاده قرار می‌گیرد. این تکنیک به محققان امکان می‌دهد تا تغییرات کمی در میزان RNA یا DNA را که نشان‌دهنده فعالیت ژنی است، به طور دقیق و در زمان واقعی اندازه‌گیری کنند. با استفاده از Real-Time PCR، پژوهشگران می‌توانند به تحلیل عمیق‌تر تأثیرات ژنتیکی ناشی از تغییرات محیطی، دارویی یا جهش‌های ژنتیکی بپردازند. به‌عنوان‌مثال، در مطالعات سرطان‌شناسی، این تکنیک می‌تواند به شناسایی و اندازه‌گیری تغییرات در بیان ژن‌های مرتبط با رشد و توسعه تومورها کمک کند و همچنین به شناسایی واریانت‌های ژنتیکی که ممکن است به پیشرفت بیماری یا پاسخ به درمان‌های مختلف مرتبط باشد.

تشخیص بیماری‌های عفونی

تشخیص بیماری‌های عفونی یکی از کاربردهای برجسته Real-Time PCR است. این تکنیک توانایی بالایی در اندازه‌گیری دقیق بار ویروسی یا باکتریایی دارد که به‌ویژه در مواردی که نیاز به تشخیص سریع و دقیق بیماری‌های عفونی وجود دارد، بسیار مفید است. برای مثال، در بیماری‌های ویروسی مانند HIV ،  SARS-CoV-2و Real-Time PCR می‌تواند به طور مؤثر میزان عفونت را اندازه‌گیری کرده و تغییرات در بار ویروسی را در طول درمان و پیگیری بیماری رصد کند. این قابلیت به پزشکان و محققان کمک می‌کند تا به طور دقیق‌تر پیشرفت بیماری را پیگیری کرده و اثربخشی درمان‌ها را ارزیابی کنند، همچنین می‌تواند در شناسایی سریع موارد جدید و پیشگیری از گسترش عفونت‌ها مؤثر واقع شود.

مطالعات بیان ژن

در مطالعات بیان ژن، Real-Time PCR  ابزار ارزشمندی برای بررسی تغییرات در سطح بیان ژن‌ها در شرایط مختلف محیطی، فیزیولوژیکی یا بالینی است. این تکنیک به محققان این امکان را می‌دهد که به طور دقیق و سریع تغییرات در فعالیت ژن‌ها را بررسی کرده و الگوهای بیان ژن را در پاسخ به محرک‌های مختلف شناسایی کنند. برای مثال، در مطالعات مربوط به استرس‌های محیطی یا دارویی، Real-Time PCR  می‌تواند به تحلیل نحوه تغییر بیان ژن‌های خاص در پاسخ به این شرایط کمک کند. این اطلاعات برای درک بهتر فرآیندهای بیولوژیکی، شناسایی مکانیزم‌های بیماری و توسعه روش‌های درمانی جدید ضروری است. به‌طورکلی، Real-Time PCR  در مطالعات بیولوژیکی و بالینی به‌عنوان یک ابزار کلیدی برای تحلیل و درک دقیق‌تر فعالیت‌های ژنتیکی عمل می‌کند.

برای کسب اطلاعات بیشتر، لطفا به صفحات پربازدید ما مراجعه کنید: انجامreal time PCR، انجام تست های مولکولی و انجام pcr

.

مزایای روش Real-Time PCR

روش Real-Time PCR مزایای زیادی دارد که به شکل زیر در جدول ارائه می‌شود:

.

.

اصول کار Real-Time PCR

.

.

حالا که قصد داریم مراحل مختلف Real-Time PCR را به طور دقیق‌تری توضیح دهیم، بیایید با یک توضیح کلی درباره هر مرحله شروع کنیم و سپس به جزئیات بپردازیم:

مرحله Denaturation (جداشدن)

در مرحله Denaturation، نمونه DNA به دمای بالا (معمولاً 94-98 درجه سانتی‌گراد) حرارت داده می‌شود تا رشته‌های دوگانه DNA از یکدیگر جدا شوند و به صورت تک‌رشته‌ای درآیند. این حرارت بالا باعث می‌شود پیوندهای هیدروژنی که دو رشته DNA را به هم متصل کرده‌اند شکسته شوند. نتیجه این مرحله، تبدیل DNA از ساختار دوگانه به دو رشته تک‌رشته‌ای است که برای مراحل بعدی آماده‌سازی می‌شود. این کار به آنزیم‌ها و پرایمرها امکان می‌دهد که به راحتی به رشته‌های DNA متصل شوند و سنتز DNA جدید آغاز شود.

مرحله Annealing (چسبیدن)

در مرحله Annealing، دما کاهش می‌یابد (معمولاً به حدود 50-65 درجه سانتی‌گراد) تا شرایط مناسب برای اتصال پرایمرها به رشته‌های تک‌رشته‌ای DNA فراهم شود. پرایمرها، که قطعات کوتاه و خاص از DNA هستند، به نواحی هدف روی رشته‌های DNA متصل می‌شوند. این مرحله بسیار حساس است، زیرا باید دما به گونه‌ای تنظیم شود که فقط پرایمرهای مناسب به DNA هدف بچسبند و اتصالات غیر اختصاصی کاهش یابد. این اتصال دقیق پرایمرها به نواحی خاص، به آنزیم DNA پلی‌مراز کمک می‌کند تا بتواند رشته‌های جدید DNA را به درستی سنتز کند.

مرحله Extension (طولانی کردن)

در مرحله Extension، دما به حدود 72 درجه سانتی‌گراد افزایش می‌یابد، جایی که آنزیم DNA پلی‌مراز فعال شده و شروع به سنتز رشته‌های جدید DNA می‌کند. این آنزیم با استفاده از نوکلئوتیدهای آزاد موجود در محیط، به انتهای 3′ رشته‌های تک‌رشته‌ای DNA متصل شده و نوکلئوتیدهای جدید را به رشته‌های در حال رشد اضافه می‌کند. این فرآیند منجر به تولید رشته‌های جدید DNA می‌شود که مطابق با الگوهای تک‌رشته‌ای DNA موجود هستند و به این ترتیب، رشته‌های جدید به ساختار DNA اولیه اضافه می‌شوند.

اندازه‌گیری فلورسانس

در پایان هر چرخه PCR، میزان نور فلورسانس تولید شده ثبت می‌شود تا مقدار DNA تولید شده اندازه‌گیری شود. در این مرحله، از رنگ‌های فلورسانس یا پروب‌های خاص استفاده می‌شود که به DNA متصل می‌شوند و نور فلورسانس تولید می‌کنند. میزان نور فلورسانس به طور مستقیم با مقدار DNA موجود در نمونه مرتبط است. با اندازه‌گیری فلورسانس، دستگاه قادر به پیگیری میزان DNA تولید شده در هر چرخه است و داده‌ها را برای تحلیل‌های بعدی ذخیره می‌کند. این امکان را می‌دهد که به‌صورت مداوم و در زمان واقعی، فرآیند تولید DNA را نظارت و بررسی کرد.

.

انواع روش‌های Real-Time PCR

در اینجا انواع روش‌های Real-Time PCR و تفاوت‌های آن‌ها را بررسی خواهیم کرد:

.

.

آماده‌سازی نمونه‌ها برای Real-Time PCR

برای انجام Real-Time PCR، آماده‌سازی دقیق نمونه‌ها و مواد واکنش حیاتی است. در ادامه به توضیح هر یک از مراحل آماده‌سازی پرداخته می‌شود:

آماده‌سازی RNA و DNA

برای شروع، باید RNA یا DNA از نمونه‌های زیستی استخراج و تصفیه شود. این فرآیند شامل هموژن‌سازی نمونه، استفاده از معرف‌های مناسب برای جداسازی اسیدهای نوکلئیک و پاک‌سازی از آلودگی‌های احتمالی است. پس از استخراج، کیفیت و کمیت RNA یا DNA باید با استفاده از روش‌های مانند اسپکتروفوتومتری یا الکتروفورز بررسی شود. این مرحله به اطمینان از خلوص و کیفیت مناسب برای واکنش‌های Real-Time PCR کمک می‌کند.

انتخاب و آماده‌سازی پرایمرها

پرایمرها باید بر اساس توالی هدف طراحی شوند تا دقت و حساسیت تست افزایش یابد. طراحی صحیح پرایمرها شامل انتخاب توالی‌های منحصربه‌فرد و اجتناب از هم‌پوشانی یا تشکیل ساختارهای ثانویه است. پرایمرها باید به طور خاص برای ناحیه هدفی از DNA طراحی شوند تا خطاهای تشخیصی به حداقل برسد. همچنین، پرایمرها باید برای شرایط واکنش بهینه شده و عملکرد آنها در آزمایش‌های پیش‌تست ارزیابی شود.

آماده‌سازی محلول‌های واکنش

محلول‌های واکنش شامل آنزیم‌های DNA پلی‌مراز، پرایمرها و رنگ‌های فلورسانس باید بادقت آماده شوند. ترکیب صحیح این مواد برای تولید نتایج معتبر و تکرارپذیر ضروری است. آنزیم‌های DNA پلی‌مراز باید به مقدار مناسب اضافه شوند تا فرآیند تکثیر به‌درستی انجام شود. همچنین، غلظت صحیح پرایمرها و رنگ‌های فلورسانس برای بهینه‌سازی سیگنال و کاهش پس‌زمینه فلورسانس بسیار مهم است.

.

انجام آزمایش Real-Time PCR

.

.

در ادامه، مراحل انجام آزمایش Real-Time PCR به‌تفصیل توضیح داده می‌شود:

تنظیم دستگاه PCR

برای اطمینان از دقت نتایج، دستگاه PCR باید بر اساس پروتکل آزمایش تنظیم شود. این شامل تنظیم دماهای مختلف برای مراحل گرمادهی، اتصال و گسترش است. همچنین، زمان هر مرحله باید مطابق با مشخصات پرایمرها و آنزیم‌های استفاده‌شده تنظیم شود. تنظیم دقیق دستگاه برای دستیابی به نتایج صحیح و تکرارپذیر حیاتی است.

اجرای چرخه‌های PCR

در این مرحله، نمونه‌ها تحت چرخه‌های حرارتی متوالی قرار می‌گیرند تا DNA به طور انتخابی تکثیر یابد. چرخه‌های حرارتی شامل دماهای بالا برای دناتوراسیون، دماهای پایین برای اتصال پرایمرها به DNA الگو و دماهای میانه برای تکثیر DNA است. این مراحل به طور خودکار توسط دستگاه PCR طبق پروتکل ازپیش‌تعیین‌شده انجام می‌شود. اجرای صحیح این چرخه‌ها برای به‌دست‌آوردن نتایج معتبر ضروری است.

مانیتورینگ و تحلیل داده‌ها

در پایان هر چرخه PCR، داده‌های فلورسانس به طور پیوسته جمع‌آوری می‌شوند تا میزان DNA تکثیرشده تحلیل شود. این داده‌ها به‌وسیله نرم‌افزارهای تحلیل Real-Time PCR پردازش شده و منحنی‌های فلورسانس برای هر نمونه رسم می‌شود. با تحلیل این منحنی‌ها، مقدار نسبی یا مطلق DNA موجود در نمونه‌ها تعیین می‌شود. دقت در تحلیل داده‌ها برای تفسیر صحیح نتایج آزمایش بسیار مهم است.

.

مشکلات رایج و راه‌حل‌ها

برای حل مشکلات رایج در Real-Time PCR، در اینجا به تحلیل مشکلات و راه‌حل‌های مربوطه پرداخته شده است:

.

.

جمع‌بندی آموزش real time PCR

Real-Time PCR تکنیکی مؤثر و دقیق برای اندازه‌گیری و تحلیل DNA و RNA است که به دلیل مزایای متعددش در تحقیقات و تشخیص‌های علمی مورداستفاده قرار می‌گیرد. با درک اصول و مزایای این تکنیک، محققان می‌توانند از آن بهره‌برداری بهینه‌ای داشته باشند.

.

سوالات متداول آموزش real time PCR

عملکرد سایبر گرین چیست؟

سایبر گرین یک‌رنگ فلورسانس است که به DNA متصل می‌شود و با استفاده از فلورسانس برای اندازه‌گیری مقدار DNA در Real-Time PCR مورداستفاده قرار می‌گیرد.

چرا سایبر گرین به DNA اتصال پیدا می‌کند؟

سایبر گرین به دلیل ویژگی‌های شیمیایی خاص خود، به DNA متصل شده و در هنگام تابش نور فلورسانس تولید می‌کند که به‌وسیله دستگاه PCR قابل‌اندازه‌گیری است.

حساسیت رنگ سایبرگرین موجود در مسترمیکس به نور چگونه است؟

رنگ سایبرگرین بسیار حساس به نور است و تغییرات در میزان نور می‌تواند بر دقت نتایج تأثیر بگذارد؛ بنابراین، در شرایط مناسب و نور مناسب باید استفاده شود.

آیا رنگ سایبرگرین بی‌خطر است؟

سایبرگرین به‌طورکلی در مقادیر مورداستفاده در آزمایش‌ها بی‌خطر است، اما توصیه می‌شود که از تماس مستقیم و طولانی‌مدت با پوست یا چشم‌ها اجتناب شود.

مواد تشکیل‌دهنده مسترمیکس سایبرگرین چیست؟

مسترمیکس سایبرگرین شامل سایبرگرین به‌عنوان رنگ فلورسانس، آنزیم‌های DNA پلیمراز، پرایمرها و سایر مواد افزودنی لازم برای انجام PCR است.