تشخیص مقاومت ESBL از کشت تا PCR: شناسایی باکتری‌های مولد β-لاکتاماز

تشخیص مقاومت ESBL در ساینس بازار انجام میشود. تعیین مقاومت Extended Spectrum Beta-Lactamase (ESBL) یکی از مهم‌ترین چالش‌ها در کنترل عفونت‌های بیمارستانی است. این مقاومت که عمدتاً توسط Escherichia coli و Klebsiella pneumoniae ایجاد می‌شود، منجر به شکست درمان با سفالوسپورین‌ها و مونوباکتام‌ها می‌گردد. در این مقاله، فرآیند تشخیص مرحله‌به‌مرحله ESBL از سطح کشت باکتری تا تشخیص مولکولی با PCR بررسی می‌شود تا دانشجویان و پژوهشگران بتوانند مسیر انتخابی مناسب را برای پروژه‌های تحقیقاتی خود طراحی کنند.

افزایش شیوع سویه‌های مقاوم به آنتی‌بیوتیک، به‌ویژه باکتری های تولیدکننده ESBL، تهدیدی جدی برای سلامت عمومی محسوب می‌شود.

از آنجا که تشخیص دقیق مقاومت میکروبی زیربنای انتخاب درمان مناسب است، آشنایی با روش‌های کلاسیک و مولکولی اهمیت ویژه‌ای دارد.

” آزمایشگاه میکروب شناسی ساینس بازار زیر نظر دانشگاه علوم پزشکی مشهد “

اماده ارائه خدمات انجام تست های میکروبی نظیر تشخیص و افتراق باکتری های ESBL مثبت و همچنین جمع اوری نمونه های باکتری با مقاومت ESBL و سایر فنوتیپ های مقاومتی از نمونه های بالینی جهت انجام طرح تحقیقاتی و یا انجام پایان نامه ها میباشد. 

انجام تست آنتی بیوگرام | تست حساسیت میکروبی | دیسک دفیوژن | کربی بائر

500,000 تومان

برای خرید کلیک کنید

جمع اوری نمونه های میکروبی جهت طرح تحقیقاتی

استعلام بگیرید: 09351245541

برای خرید کلیک کنید

باکتری‌های تولیدکننده ESBL

آنزیم‌های ESBL (Extended-Spectrum Beta-Lactamases) خانواده بزرگی از آنزیم‌ها هستند که توانایی باکتری برای تجزیه و غیرفعال کردن گسترده‌ای از آنتی بیوتیک های بتالاکتام‌ (مانند پنی‌سیلین‌ها، سفالوسپورین‌های نسل سوم و چهارم، و مونوباکتام‌ها) را فراهم می‌کنند.

باکتری‌هایی که توانایی تولید ESBL دارند عمدتاً شامل موارد زیر هستند:

۱. خانواده انتروباکتریاسه (Enterobacteriaceae) – شایع‌ترین میزبان

این گروه بیشترین بار بیماری و شایع‌ترین گزارش‌های ESBL را به خود اختصاص داده‌اند و شامل باکتری‌های گرم-منفی شایع در عفونت‌های بیمارستانی و کسب شده از جامعه (CAI) هستند:

• Escherichia coli: یکی از شایع‌ترین تولیدکنندگان ESBL در سطح جهان است.
• Klebsiella pneumoniae: به‌خصوص گونه‌هایی که تولیدکننده تولید انبوه آنزیم هستند (مانند KPC، که زیرمجموعه‌ای از سِرین بتالاکتامازها است و اغلب با ESBL دیده می‌شود).
• Proteus mirabilis
• Enterobacter species (مانند E. cloacae complex)
• Citrobacter freundii

۲. باکتری‌های گرم-منفی غیر انتروباکتریاسه (Non-Enterobacteriaceae)

این گروه نیز به‌طور فزاینده‌ای در حال گزارش تولید ESBL هستند و اهمیت آن‌ها در تشخیص افتراقی بالینی افزایش یافته است:

• Pseudomonas aeruginosa: این باکتری به‌طور ذاتی مقاومت‌های متعددی دارد، اما سویه‌هایی که ژن‌های ESBL (به‌ویژه CTX-M) را کسب می‌کنند، درمان آن‌ها بسیار دشوار می‌شود.
• Acinetobacter baumannii: یک پاتوژن مهم بیمارستانی که مقاومت چند دارویی (MDR) و تولید ESBL در آن بسیار رایج است.

نکته مهم برای پژوهش دانشجویی (ESBL در مقابل سایر بتالاکتامازها)

در مقالات، بسیار مهم است که تمایز قائل شوید:

1. ESBLها (مانند TEM، SHV، CTX-M): این آنزیم‌ها معمولاً توسط پلاسمیدها منتقل می‌شوند و حساسیت به مهارکننده‌های کلاسیک بتالاکتام (مانند Clavulanic Acid) را از بین می‌برند.
2. Carbapenemases (مانند KPC، NDM): این‌ها مقاومت در برابر کارباپنم‌ها (قوی‌ترین بتالاکتام‌ها) ایجاد می‌کنند و اغلب به‌عنوان یک سطح بالاتر از مقاومت ESBL در نظر گرفته می‌شوند، اگرچه اغلب با ژن‌های ESBL هم‌زمان در یک باکتری یافت می‌شوند.

تشخیص مقاومت ESBL باکتری

بخش ۱: مرحله کشت و غربالگری اولیه

در مرحله اول، ایزوله‌های بالینی یا آزمایشگاهی بر روی محیط‌های مغذی مانند MacConkey agar یا Blood agar کشت داده می‌شوند.

ویژگی رشد کلونی، تغییر رنگ، و نوع همولیز اولیه به انتخاب سویه مشکوک کمک می‌کند. چنانچه باکتری باسیل گرم منفی به خصوص از خانواده انتروباکتریاسه بود تست غربالگری تشخیص ESBL به روش آنتی بیوگرام انجام میشود.

تست غربالگری آنتی‌بیوتیکی:

• استفاده از دیسک‌های cefotaxime و ceftazidime.
• کاهش چشمگیر قطر هاله مهار احتمال وجود ESBL را مطرح می‌کند.

این مرحله به‌عنوان تست مقدماتی در اکثر پروژه‌های دانشجویان ارشد ضروری است.

بخش ۲: تست تأییدی فنوتیپی (Confirmatory Test)

برای تأیید مقاومت، از آزمون Double-Disk Synergy Test (DDST) استفاده می‌شود که تعامل بین دیسک سفالوسپورین (cefotaxime و ceftazidime)  و clavulanic acid را نشان می‌دهد.

افزایش قطر هاله در حضور مهارکننده بیانگر وجود آنزیم ESBL است.

مزیت این روش:

• ساده، سریع، و قابل اجرا در آزمایشگاه‌های دانشگاهی.

محدودیت:

• عدم تشخیص تیپ دقیق ژن مقاومت، فقط نشان‌دهنده فنوتیپ است.

آنتی‌بیوتیک‌هایی که برای غربالگری استفاده می‌شوند، باید بتوانند توسط آنزیم‌های ESBL تجزیه شوند:

۲. روش اجرای تست (دیسک دیفیوژن)

این تست روی یک محیط کشت آگار (معمولاً مولر-هینتون آگار) انجام می‌شود:

1. تهیه سوسپانسیون: یک کلونی خالص از باکتری مشکوک برداشته شده و در نرمال سالین معلق می‌شود تا غلظتی معادل ۰.۵ مک‌فارلند ایجاد شود (تقریباً 1.5×10 به توان 8 CFU/mL).
2. پخش شدن روی آگار: با استفاده از سواب استریل، سطح محیط کشت به‌طور یکنواخت با سوسپانسیون باکتری پوشانده می‌شود.
3. قرار دادن دیسک‌ها: دیسک‌های کاغذی حاوی غلظت‌های استاندارد آنتی‌بیوتیک‌های مورد نظر (مثلاً سفوتاکسیم CTX با غلظت ۳۰ میکروگرم یا سفتازیدیم CAZ) و دیسک ترکیبی با کلاولونیک اسید (برای مثال دیسک سفتازیدیم – کلاولونیک اسید یا دیسک سفوتاکسیم – کلاولونیک اسید) بر روی آگار قرار داده می‌شوند.
4. انکوباسیون: پتری‌دیش‌ها به مدت ۱۶ تا ۱۸ ساعت در دمای 37 درجه انکوبه می‌شوند.
5. اندازه‌گیری: قطر ناحیه مهار (Zone of Inhibition) اطراف دیسک‌ها با خط‌کش بر حسب میلی‌متر اندازه‌گیری می‌شود.

تفسیر نتیجه “مثبت بودن ESBL” (بر اساس CLSI):

ایزوله ESBL است اگر کاهش قطر هاله (Synergistic Effect) بین دیسک آنتی‌بیوتیک تنها و دیسک آنتی‌بیوتیک + CLA کلاولونیک اسید مشاهده شود.

توضیح:

• غربالگری اولیه (Screening): مقاومت به CTX/CAZ به‌تنهایی (همانطور که در جدول قبلی اشاره شد، یعنی CTX $\text{ mm}$).
• تأیید (Confirmation): اگر غربالگری مثبت شد، باید تأیید شود که این مقاومت ناشی از ESBL است یا خیر. این تأیید با نشان دادن افزایش قابل توجه (حداقل ۵ میلی‌متر) در قطر هاله در حضور اسید کلاوولانیک (مهارکننده ESBL) حاصل می‌شود.

بخش ۳: تشخیص مولکولی با PCR

در مرحله نهایی، استخراج DNA با روش‌های استاندارد مانند Boiling Method یا Phenol-Chloroform انجام می‌شود.

سپس با استفاده از پرایمرهای اختصاصی، ژن‌های مقاومتی معمول شامل:

• blaTEM, blaSHV, blaCTX-M

آمپلیفای (تکثیر) شده و بر روی ژل آگاروز ران می‌شوند.

نکته کلیدی تحقیقاتی:

PCR نه‌تنها وجود ژن مقاومت را تأیید می‌کند، بلکه امکان تیپ‌بندی مولکولی سویه‌ها را نیز فراهم می‌سازد — موردی که برای پایان‌نامه‌های تحصیلات تکمیلی حیاتی است.

انجام تست آنتی بیوگرام | تست حساسیت میکروبی | دیسک دفیوژن | کربی بائر

500,000 تومان

برای خرید کلیک کنید

جمع اوری نمونه های میکروبی جهت طرح تحقیقاتی

استعلام بگیرید: 09351245541

برای خرید کلیک کنید

مکانیسم مولکولی ESBL ، فعالیت آنتی‌بیوتیکی علیه بتالاکتام‌ها و نقش ESBLها

مقاومت میکروبی باکتری ESBL در برابر آنتی‌بیوتیک‌های بتالاکتام (Beta-lactam antibiotics)، که شامل پنی‌سیلین‌ها، سفالوسپورین‌ها و کارباپنِم‌ها می‌شوند، عمدتاً از طریق تولید آنزیم‌های خانواده بتالاکتاماز (Beta-lactamases) رخ می‌دهد. این آنزیم‌ها در باکتری ESBL با مکانیسم آبکافت شیمیایی (Chemical Hydrolysis) ، حلقه بتالاکتام (مولفه فعال آنتی‌بیوتیک) را تخریب می‌کنند.

۱. هدف اصلی انتی بیوتیک های بتالاکتام : دیواره سلولی و پپتیدوگلیکان

آنتی‌بیوتیک‌های بتالاکتام کار خود را با تقلید از ساختار D-Ala-D-Ala (دو انتهای دی‌آلانین) در پیش‌سازهای پپتیدوگلیکان، انجام می‌دهند. آن‌ها به‌طور کووالانسی به محل فعال آنزیم‌های پنی‌سیلین-بیندینگ پروتئین‌ها (PBPs) متصل شده و مانع از فرایند نهایی ساخت دیواره سلولی باکتری می‌شوند.

۲. مکانیسم عمل آنزیم بتالاکتاماز (Hydrolysis)

بتالاکتامازها متعلق به خانواده بزرگی از آنزیم‌های سرین هیدرولاز (Serine Hydrolases) هستند (کلاس A, C, و D بر اساس طبقه‌بندی آمش (Ambler Classification)). مکانیسم کلی آن‌ها شامل دو مرحله کلیدی است:

مرحله اول: استیلاسیون (Acylation)

آنزیم بتالاکتاماز به حلقه بتالاکتام حمله نوکلئوفیلی انجام می‌دهد. یک باقی‌مانده سرین فعال در محل فعال آنزیم، به کربنیل گروه استیل در آنتی‌بیوتیک حمله کرده و یک پیوند کووالانسی ناپایدار (به نام کمپلکس آسیل-آنزیم) تشکیل می‌دهد. در این مرحله، آنتی‌بیوتیک شکسته شده و اثر خود را از دست می‌دهد.

مرحله دوم: داستیلاسیون (Deacylation)

کمپلکس آسیل-آنزیم در برابر حمله یک مولکول آب (یا یک باقی‌مانده سرین دیگر که به‌عنوان کاتالیزور آب عمل می‌کند) ناپایدار است. پیوند بین آنزیم و مولکول تخریب‌شده شکسته شده و آنزیم آزاد می‌شود تا بتواند یک مولکول آنتی‌بیوتیک دیگر را تخریب کند.

۳. مکانیسم مولکولی ESBLها (Extended-Spectrum Beta-Lactamases)

ESBLها زیرمجموعه‌ای از بتالاکتامازهای کلاس A هستند که جهش‌هایی در محل فعال خود پیدا کرده‌اند که دامنه فعالیت آن‌ها را به‌طور قابل توجهی گسترش داده است.

تفاوت کلیدی ESBL با بتالاکتامازهای سنتی (مانند TEM-1):

نقش جهش در تغییر دامنه فعالیت

در ESBLها، جهش‌های خاصی (اغلب در نواحی مجاور محل اتصال سوبسترا در آنزیم) منجر به افزایش فاصله بین آنزیم و حلقه بتالاکتام سفالوسپورین‌های بزرگ‌تر (نسل سوم) می‌شود. این تغییر فضا اجازه می‌دهد:

1. اتصال موثر: آنتی‌بیوتیک‌های بزرگ‌تر بتوانند وارد محل فعال شوند.
2. آبکافت کارآمد: آنزیم بتواند با موفقیت مرحله استیلاسیون را روی این سوبستراهای جدید انجام دهد.

۴. تفاوت با کارباپنمازها (Carbapenemases)

برای اینکه در مقاله تفکیک واضحی داشته باشیم، اشاره به کارباپنمازها مهم است:

• ESBL: عمدتاً سفالوسپورین‌های نسل سوم را تخریب می‌کنند و اغلب توسط اسید کلاوولانیک مهار می‌شوند (در تست‌های تأییدی).
• کارباپنمازها (مانند KPC): این‌ها تغییر شکل‌یافته‌تر هستند که حتی حلقه کارباپنِم (قوی‌ترین بتالاکتام‌ها) را نیز آبکافت می‌کنند. مکانیسم آن‌ها معمولاً از طریق تغییرات در ناحیه سوبسترا است که اجازه ورود کارباپنِم‌ها را می‌دهد و اغلب حتی در حضور کلاوولانات نیز فعال باقی می‌مانند.

بحث و نتیجه‌گیری

ترکیب روش‌های کلاسیک و مولکولی، تصویر دقیق‌تری از مقاومت آنتی‌بیوتیکی ارائه می‌دهد.

دانشجویان ارشد و دکتری می‌توانند با استفاده از این رویکرد ترکیبی، ضمن اطمینان از صحت نتایج، زمینه چاپ مقاله علمی در ژورنال‌های بین‌المللی را فراهم آورند.

پیشنهاد:

برای پروژه‌های دانشگاهی، اجرای هم‌زمان تست فنوتیپی و PCR در آزمایشگاه‌هایی مانند ساینس بازار، بعنوان یک رویکرد استاندارد و قابل اعتماد توصیه می‌شود.