کیت MTT چیست؟ معرفی و کاربرد

کیت MTT چیست؟ معرفی و کاربرد

[lwptoc]

در مقاله کیت MTT چیست؟ معرفی و کاربرد به دنبال معرفی این کیت و کاربرد و موارد استفاده از آن هستیم. در ادامه این مقاله با ما همراه باشید.

مقدمه | کیت MTT چیست؟ معرفی و کاربرد

آزمایش MTT به عنوان آزمایشی برای بررسی زنده ماندن سلول یا بررسی اثر سمی داروها یا سایر مکمل‌ها بر روی سلول ‌ها استفاده می ‌شود ، که به تشخیص سلول ‌های زنده از سلول ‌های مرده با تأثیر بر اندامک ‌های درون سلولی کمک می ‌کند .

فعالیت و سرعت تکثیر سلولی می تواند تحت تأثیر فاکتورهای رشد ، هورمون ها ، میتوژن ها و سیتوکین ها افزایش یابد یا بدون تغییر باقی بماند . علاوه بر این ، برخی داروها و عوامل سیتوتوکسیک مانند داروهای ضد سرطان می توانند باعث نکروز یا آپوپتوز سلولی شوند ، سرعت تکثیر و رشد را کاهش دهند یا ساختار سلولی را از بین ببرند .

خرید کیت MTT از ساینس بازار

کیت MTT  چیست ؟

یک کیت حساس برای اندازه گیری تکثیر سلولی بر پایه احیای MTT است . اساس این تست ، احیای MTT به ماده رنگی نامحلول فرمازان از فعالیت گلیکولیتیک در داخل سلول است و به حضور NADH وNADPH بستگی دارد. بطور معکوس ، در سلول هایی که دچار آپوپتوزیس می شوند ، احیای MTT کاهش می یابد که بیانگر مرگ سلولی است . مقایسه این مقدار با مقدار بدست آمده از یک کنترل فاقد تیمار، باعث افزایش نسبی تکثیر سلولی می شود که ناشی از فاکتورهای تروفیک، مهارکننده های رشد ، یا القا کننده ها  مهارکننده های آپوپتوزیس بوده و قابل اندازه گیری است . در سلول های بطور فعال تکثیرشونده، افزایش تبدیلMTT از طریق اسپکتروفوتومتر اندازه گیری می شود .

روش انجام تست MTT

تست MTT به صورت تکرار سه تایی مطابق مراحل زیر انجام می شود :

1. تهیه سوسپانسیون سلولی در رقت مناسب از سلول ها و با شمارش ان ها سلولی حاصل می شود

2. افزودن مقدار 200 میکرولیتر از سوسپانسیون سلولی به هر حفره از پلیت 96 خانه ای کشت سلولی برای این که در هر حفره به طور میانگین 103×5 سلول وجود دارد ، انجام تست تریپان بلو و شمارش تعداد سلول ها ضروری است .

3. انکوباسیون 24 ساعت برای اطمینان از چسبیدن سلول ها به بستر در انکوباتور 5CO و با رطوبت 100%

4. بعد 24 ساعت بستر کشت را از حفرات خارج کرده و اگر سلول ها به حفره ها چسبیده باشند میتواند با وارونه کردن پلیت این کار را انجام دهد و اگر سلول ها معلق باشند با سانتریفوژهای مخصوص پلیت این کار انجام می گردد. بعد از ان دوویست میکرولیتر محیط کشت تازه به هر خانه اضافه شود .

5. به هر حفره بیست میکرولیتر محلول رنگ MTT اضافه می شود پلیت در فویل آلومینیومی پوشانده می شود و به مدت 4 ساعت در انکوباتور انکوبه می شود .

6. پس از طی زمان ، محیط کشت سلول ها را خالی می کنند و به هر حفره ای صد میکرولیتر از DMSO و ده میکرولیتر بافر گلایسین می افزاییم .

7. با سمپلر محیط و سلول ها را خوب مخلوط می کنیم تا رنگ های تولید شده به طور کامل حل شوند .

8. جذب نوری هر ، حفره توسط اسپکتروفتومتر در طول موج 570nm خوانده می شود .

9. در قیاس با شاهد و کنترل های مثبت و منفی می توان منحنی های مربوطه را رسم نمود ..

نكات كليدی در اجرای آزمون MTT

• تعداد سلول ها درون هر چاهک باید بین 103/105 سلول باشد .
• بهتر است محلول سلولی یک نواخت و یکدست باشد تا تراكم سلول ها در هر چاهک یک مدل بماند و تاثير دارو روی جمعيت سلولی دقيق تر مشخص شود .
• تعداد درست سلول ها برای هر چاهک کاری بسیارحیاتی و اضطراری است .
• حتما در انجام تست باید دقت و تمرکز کافی ترکیب کار شود و محاسبات هم دقیق انجام شود .
• برای هر رده سلولی حداقل سه بار آزمايش را تكرار كنيد تا احتمال وقوع خطا كاهش پيدا کند .
• درون چاهک های پلیت دستگاه ، باید تعداد کم و مشخصی سلول کشت شود و از تعداد مجاز نباید بیشتر یا کمتر باشد .

چه لزومی دارد که تست سمیت سلولی اجرا شود ؟

1. در آنالیز استاندارد بین المللی ISO 10993-5 تجهیزات مختلف از لحاظ سمیت سلولی مورد آزمایش قرار می گیرند تا در صورتی که فاقد اثرات سمی باشند ، استاندارد ها و مجوزهای لازم را کسب کرده و وارد بازار خرید و فروش شوند .

1. آزمون هایی که اثرات ناخواسته ترکیبات مختلف روی سلول را مورد بررسی قرار می دهد . این کارها  در محیط بیرونی بدن انسان انجام می گیرند .  بعضی از این کار ها نیز از کشت سلولی استفاده می کنند .

1. قانون بهداشت می گوید که برای استفاده از هر ماده یا ابزار بهداشتی که با انسان تماس مستقیم دارد ، تست سمیت سلولی انجام شود و نداشتن سمیت سلولی یکی ازدلایل اصلی ورود محصولات مختلف به بازار وسایل پزشکی هستند .

کاربرد کیت سنجش زنده مانی MTT 

• از این کیت برای بررسی اثر ترکیبات دارویی بر سلول‌ ها استفاده می‌ شود .
• در مطالعات سلولی ، این کیت باعث می‌ شود روند رشد یا جلوگیری از رشد سلول‌ ها به صورت کمی مورد بررسی قرار می گیرد .
• کیت MTT این امکان را می‌ دهد که زنده مانی و تکثیر سلول‌ ها در کشت مورد بررسی قرار گیرد .
• در درمان و فارماکولوژی ، کیت MTT امکان ان را می‌ دهد اثربخشیدن داروهای ضد سرطان یا آنتی ویروسی بررسی شود .
• در بیوتکنولوژی و نانوفناوری ، MTTکمک می‌ کند زندگی سازگاری نانو ذرات یا بیومواد بررسی شوند .

محاسبه درصد سلول های زنده در کیت MTT 

۱۰۰ × جذب متوسط نمونه‌های کنترل / جذب متوسط نمونه‌های تیمار شده = درصد سلول‌های زنده

رنگ آمیزی MTT

ده لاندا محلول استوک MTT به هر چاهک اضافه کنید .

پلیت را دو الی چهار ساعت در 37 درجه انکوبه کنید . و از یک میکروسکوپ ، به صورت متداول سلول ها را برای بروز کردن نقاط رسوب داخل سلولی مورد بررسی قرار دهید و برخی از انواع مختلف سلول ها به زمان بیشتری حتی تا 24 ساعت نیاز دارند .

بعد از نگاه کردن رسوب واضح ارغوانی زیر میکروسکوپ ، 100 میکرولیتر به هر چاهک مخصوصا چاهک کنترل اضافه کنید و نیاز به برداشتن MTT یا محیط  قبل از افزودن حلال نیست . اصلا تکان ندهید .

پلیت را با کاور مناسب بپوشانید و برای حداقل دو ساعت تا یک شبانه روز در 24-18 درجه قرار دهید . می تواند جذب نمونه ها را بعد  از دو ساعت دیدن اما اگر جذب پایین بود و همچنان کریستال باقی مانده بود پلیت را به قسمت تاریکی برگردانید و برای مدت  زمان بیشتری انکوبه انجام دهید .

نتیجه‌گیری کیت MTT چیست؟ معرفی و کاربرد

آزمایش MTT روشی تاثیر گذارو رایج برای سنجش زنده‌ مانی و میزان سمیت سلولی است که بر پایه فعالیت متابولیک میتوکندری انجام می ‌شود . این تست با تبدیل MTT به فرمازان ، سلول‌های زنده را از مرده تشخیص می ‌دهد و امکان بررسی اثر داروها ، مواد شیمیایی یا مکمل‌ ها را فراهم می ‌سازد. دقت بالا ، سهولت انجام و قابلیت استفاده در مطالعات مختلف ، از جمله مزایای مهم این روش هستند . در نتیجه ، تست MTT ابزاری کاربردی و قابل اعتماد در تحقیقات دارویی و سلولی است که به ارزیابی اثربخشی یا سمیت ترکیبات مختلف کمک می‌ کند .