مقدمه: خدمت ریل تایم PCR

آنالیز ریل تایم  PCR یا Real Time PCR یکی از پیشرفته ترین و دقیق ترین روش ها برای آنالیز کردن بیان ژن است. در مقابل روش های معمولی آنالیز بیان ژن مانند PCR روشی اسان تر و کم هزینه تر است که نیاز به RNA کمتری دارد.

ولی بازهم  با این روش فقط  می شود سطوح بیان ژن ها را در پایان واکنش ها و با الکتروفورز محصول PCR روی ژل آگارز دید. RT-PCR می تواند بسیار بیشتر برای پی بردن به حضور یا عدم حضور یک ژن خاص مفید باشد.

در واقع آنالیز Real Time PCR تستی کیفی یا نیمه کمی است . با این حال با روش ریل تایم نمی شود  به طور کمی به شناسایی بیان ژن خاصی پرداخت . مزیای دیگر این روش، دیدن بشتر شدن ارام محصولات PCR در طول آزمایش ، اندازه گیری تعداد کپی RNA ژن در مرحله شروع و آلودگی کمتر است.

در این روش  موقع انجام واکنش می ‌توانیم ، بخش کوچکی از محصول PCR را (DNA, cDNA, RNA) به‌ صورت کمی بررسی کرد . تکنیک PCR مبتنی بر فلورسنت باعث به دگرگونی در اندازه‌گیری کمی DNA   وRNA شده است.

RT-PCR یا ریل تایم PCR مبتنی بر شناسایی فلورسنت تولیدشده توسط مولکول ریپورتر است که با پیشرفت واکنش افزایش می‌یابد. این امر به دلیل تجمع محصول PCR با هر مرحله از امپیلیفیکاسیون رخ می‌دهد. مولکول‌های ریپورتر فلورسنتی شامل رنگ‌هایی مانند SYBR® Green یا پروب های اختصاصی مانند Beacons یا TaqMan® هستند که به DNA دو رشته‌ای متصل می‌شوند.

در این روش می‌توان با حداقل میزان اسید نوکلئیک شروع کرد و محصول نهایی را دقیقاً اندازه‌گیری نمود. علاوه بر این، دیگر به پردازش پس از PCR نیازی نیست و بدین‌صورت در مواد مصرفی و زمان می‌توان صرفه‌جویی کرد. این روش دارای یک چرخه اضافی رونویسی معکوس بوده که منجر به تشکیل یک مولکول DNA از یک مولکول RNA می‌شود. این کار به این دلیل انجام می‌شود که RNA نسبت به DNA پایداری کمتری دارد.

انجام Real time PCR در ساینس بازار

مراحل ریل تایم PCR

مرحله نخست در واکنش PCR در زمان واقعی تبدیل RNA به DNA مکمل است . این فرآیند به عنوان رونویسی برعکس نامبرده می شود . در مرحله بعد از خبرنگاران فلورسنت و واکنش PCR  برای تقویت و شناسایی ژن های خاص استفاده می شود . دو نوع گزارشگر فلورسنتبه طور معمول مورد استفاده قرار میگیرد . این ها کاوشگرهای SYBR green و Taqman هستند .

کاوشگر Taqman از یک پروب اسید نوکلئیک اسید مخصوص ژن ساخته شده است که به مولکولهای گزارشگر و quencher پیوسته است. این پروب بین آغازگر جلو و معکوس به DNA متصل می شود . در حالی که گزارشگر و quencher به کاوشگر متصل هستند ، quencher  فلورسانس ساطع شده به وسیله خبرنگار را جذب می شود . در طول مراحل واکنش PCR ، پروب تخریب شده ، خبرنگار را آزاد می کند و اجازه می دهد تا فلورسانس آن شناسایی شود . خوبی روش Taqman این است که پروب هایی با گزارشگرهای رنگی متفاوت می توانند در روش های مالتی پلکس ترکیب شوند .

از دیگر مواد مهم برای سنتز cDNA، پرایمرها هستند که برای این کار 3 نوع پرایمر وجود دارد

انواع پرایمرها

پرایمرهای اختصاصی

پرایمرهای اختصاصی برای نقاط  شناخته شده ای از mRNA ها با توالی مشخص طراحی می شوند. در واقع باعث بهینه سازی توالی مورد نظر می گردند و در کلونینگ کاربرد دارند. مواد دیگری که در سنتز cDNA نقش دارند شامل نوکلئوتیدها( dNTPها)، بافر آنزیم RT، آنزیم ریبونوکلئاز و RNase H  که وظیفه ی جداسازی دو رشته ی RNA و cDNA سنتز شده از هم را دارد، می باشد . که به طور معمول همه این مواد به صورت مخلوطی در کیت های سنتز cDNA در ویالی تحت عنوان Master Mix موجود می باشد و نیازی به ریختن آن ها به صورت جدا از هم نیست .

پرایمرهای رندوم هگزامر

توالی های کوچک 6 نوکلئوتیدی که به صورت تصادفی به هر جایی از RNA امکان اتصال دارند . این پرایمرها زمانی که بخواهیم بیان تمام ژن ها را تحت هر شرایطی با هر ژن کنترلی حتی 18s  rRNA بررسی کنیم کاربرد دارد.

پرایمرهای OligodT

این پرایمرها به اخر  mRNA  دارای توالی polyA   اتصال پیدا می کنند .

تعدادی از کاربرد های این تکنیک عبارتند از :

• مشخص کردن مقدار برداشت ژن gene expression در شرایط متفاوت
• شناسایی و شمارش ویروس ها ، باکتری ها و قارچ ها در نمونه های بالینی
• عیین هویت افراد و پدیده های قانونی
• کلون سازی و نقشه برداری ژن ها
• شناسایی جهش ها ، SNP ها و ژنهای بردار transgene در DNA

مزایای  Real time PCR نسبت به PCR

• پیچیدگی کمتر در تعیین کمیت نمونه .
• این نگاهی به واکنشی می ‌دهد و کمک کننده این است که تصمیم بگیریم کدام واکنش ‌ها خوب کار کرده‌ اند و کدام‌یک درست عمل نکرده است .
• سریعتر از PCR معمولی .
• به اجرا کردن محصول PCR بر روی ژل پس از واکنش نیازی نیست چون تجزیه و تحلیل منحنی مذاب این هدف را انجام می دهد .
• بازده واکنش را می توانید به طور دقیقاً محاسبه کرد .
• داده های PCR ریل تایم را می توان برای انجام تجزیه تحلیل کمی بیان ژن استفاده کرد. درقبال،  PCR قدیمی در بهترین حالت فقط نیمه کمی بود .

بر خلاف PCR آماده سازی معمولی،  Real Time PCR اجازه می دهد تا موفقیت واکنش PCR چندگانه به طور خودکار پس از چند سیکل، بدون تجزیه و تحلیل جداگانه هر واکنش، تعیین شده و از مشکل “منفی کاذب” جلوگیری شود.

معنی مفاهیم تکثیری در ریل تایم PCR

تعداد مولکول‌های DNA موجود در واکنش اولیه ، مشخص کننده مقدار امپلیکون تولید شده بعد از یک چرخه PCR است . اگر اول کار PCR تعداد کمی مولکول DNA موجود باشد، تعداد کمی امپلیکون سنتز می‌شود . متقابلا، اگر مقدار زیادی مولکول اولیه وجود داشته باشد ، مقدار محصول بالاتر خواهد بو د. رابطه این بین امکان استفاده از PCR را برای محاسبه تعداد مولکول‌های DNA موجود در نمونه  ‌ها با شناسایی مقدار محصول تولید شده فراهم می‌کند .

این به دلایلی مانند  حضور بازدارنده‌ های واکنش پلیمراز ، محدودیت واکنشگر و جمع شدن مولکول‌ های پیروفسفات بستگی دارد . توانایی بررسی محصول PCR به صورت همزمان ، مخصوصا در فاز نمایی ،  PCR زمان واقعی را یک روش کمی قابل اعتماد می‌کند .

چون در این فاز، واکنش PCR، یک رابطه کمی منظم بین مقدار DNA شروع کننده و مقدار محصول PCR برقرار میکند . با شناسایی تعداد امپلیکون در فاز نمایی ، امکان بازگشت به عقب به مقدار DNA شروع کننده در واکنش وجود دارد.